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豬卵泡顆粒細胞表型分析!!!

返回列表 來源:未知 發布日期:2021-03-29 08:55【

    探討干擾和過表達BAMBI基 因對豬卵泡顆粒細胞的表型和功能的影響以及其對 TGF-β通路下游相關基因及凋亡基因的表達調控, 為解析豬卵泡發育和排卵數量調控機理提供依據。大腸桿菌DH5α感受態細胞、無毒素質粒小提/ 大提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、酵 母提取物、胰蛋白胨均購自天根生化科技(北京)有 限公司;限制性內切酶 NotⅠ、BamHⅠ和 EcoRⅠ、 T4DNA 連接酶和 RNA 逆轉錄試劑盒均購自寶生 物工程(大連)有 限 公 司;總 RNA 提取試劑盒購自 上海普洛麥格生物制品有限公司;氨芐青霉素購自 哈爾 濱 制 藥 六 廠;Lipofectamine2000 和 DMEM/ F12均購 自 英 杰 生 命 技 術 有 限 公 司;青 霉 素 購 自 Amresco公司;AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測 試劑盒購自 CST 公司。 超凈工作臺購自上海博迅醫療設備廠;超低溫 冰箱(-80 ℃)和臺式 高 速 離 心 機 均 購 自 賽 默 飛 世 爾 科 技 公 司;CyclerTM ThermalCyclerPCR 儀、儀均購自Bio-Rad公司;DNP-9052型電熱恒溫培養 箱和 DKB-5-1A 型超恒溫水浴鍋均購自上海精宏實 驗設備有限公司;DHG-9240AS型電熱恒溫鼓風干 燥箱購自寧波東南儀器有限公司;MO-2270MI(N) 微波爐購自青島海爾制品有限公司。

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    利用實時熒光定量 PCR 方法 檢 測 卵 泡 顆 粒 細 胞過表達和 干 擾 BAMBI后,TGF-β信 號 通 路 中 下 游基 因(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、 SMAD3、SMAD4、SMAD5)和 細 胞 凋 亡 基 因(Bax、 Bcl-2)mRNA 的 表 達 水 平,以 GAPDH 為 內 參 基 因。根據 NCBI公布的豬基因編碼區,利用 Primer Premier5.0設計實時熒光定量 PCR 引物,送生工 生物工程(上海)股份有限公司合成,PCR 反 應 體 系 25μL:cDNA 模 板 1μL, SYB Green Mix 染 料 12.5 μL,上、下 游 引 物 (10μmol/L)各1μL,ddH2O9.5μL。實時熒光定 量 PCR 反 應 程 序:95 ℃ 預 變 性 5 min;95 ℃ 變 性 10s,退火(具體溫度見表2)20s,72℃延伸10s,共 45個循環;72℃延伸4min;4℃保存。試驗對所有 樣本均進行3個重復測定,并在每次試驗時用同體 積的無菌水作為陰性對照。





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